染色质免疫共沉淀（ChIP）实验方法及步骤详解
- 培训职业
- 2025-05-04 18:46:05
染色质免疫共沉淀（ChIP）实验是研究基因调控的重要工具。其原理是在保持组蛋白和DNA结合的同时，利用针对特定组蛋白标记的生物抗体将染色质切成小片段并沉淀。此方法由抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”与免疫球蛋白FC片段的结合发展而来。目前，常用精制的prorein A预结合到agarose珠上，通过与含有抗原的溶液及抗体反应，从而精制抗原。
实验准备包括细胞样品和一系列试剂、试剂盒、仪器和耗材。具体步骤如下：
一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）
首先，将细胞与甲醛反应以交联，37℃孵育10分钟后终止交联，随后用甘氨酸终止反应并清洗细胞。接着收集细胞并加入含有蛋白酶抑制剂的SDS裂解液，超声破碎细胞。
二、除杂及抗体哺育（第一天）
超声破碎后，通过离心去除不溶物质，留取部分样本用于实验，其余样本保存。在实验样本中加入抗体或对照，按照特定步骤处理并检测超声破碎效果。
三、检验超声破碎的效果（第一天）
取一部分超声破碎产物加入5M NaCl解交联，并用酚/氯仿抽提，电泳检测破碎效果。
四、免疫复合物的沉淀及清洗（第二天）
将实验样本过夜孵育，随后添加ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA沉淀复合物，并通过一系列清洗步骤去除杂质。
五、DNA样品的回收（第三天）
在完成清洗步骤后，通过特定缓冲液解交联，加入RNaseA、EDTA、蛋白酶K等试剂处理后，使用omega胶回收试剂盒回收DNA片段，并将DNA溶于ddH2O中。
六、PCR分析（第三天）
最后，通过PCR分析回收的DNA片段以验证ChIP实验结果。实验过程中需注意抗体和缓冲液的选择，以确保实验的成功和准确性。
执行ChIP实验时，需注意抗体的特异性、抗原溶解缓冲液的性质、实验温度控制以及抗体与缓冲液比例的调整。合理设置实验条件，可提高ChIP实验的效率和准确性。
上一篇
日语一级算职业技能等级吗
下一篇
双节棍如何玩
多重随机标签