非对称引物的应用

不对称PCR　　不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA).这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1.在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA.不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例.还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双键DNA，(dsDNA)，然后以此dsDNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备ssDNA.不对称PCR制备的ssDNA，主要用于核酸序列测定. 不对称PCR（Asymmetric PCR）的基本原理是采用不等量的一对引物产生大量的单链DNA（ss-DNA）。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物；其最佳比例一般为1：50～1：100，关键是限制引物的绝对量。限制性引物太多太少，均不利于制备ss-DNA。也可用普通PCR制备靶DNA双链DNA（ds-DNA），再以ds-DNA为模板，只用其中一种过量引物进行单引物PCR制备ss-DNA。 　　产生的ds-DNA与ss-DNA由于分子量不同可以在电泳中分开，而得到纯ss-DNA。 　　不对称PCR主要为测序制备ss-DNA，尤为用cD－NA经不对称PCR进行DNA序列分析是研究真核DNA外显子的好方法。

一种不对称PCR扩增方法及其专用引物与应用　 　

申请专利号 CN200410056866.0 　

专利申请日 2004.08.26 　

名称 一种不对称PCR扩增方法及其专用引物与应用　 　

公开（公告）号 CN1629305

公开（公告）日 2005.06.22 　

类别 化学；冶金

颁证日 　

优先权

申请（专利权） 北京博奥生物芯片有限责任公司;清华大学 　

地址 102206北京市昌平区生命科学园路18号　

发明（设计）人 张治位;王璨;祝令香;张琼;程京 　

国际申请

国际公布

进入国家日期 　

专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限公司 　

代理人 关畅 　

摘要

本发明公开了一种不对称PCR扩增方法及其专用引物与应用，目的是提供一种能简单、高效的制备单链扩增产物的PCR扩增方法。本发明所提供的不对称PCR引物，包括若干对PCR引物对，其特征在于：每对所述引物对中的一条引物的5′末端均加有一段与待扩增靶序列无关的寡核苷酸尾。所提供的不对称PCR扩增方法，包括如下步骤：1)预变性；2)包括若干变性、引物退火和引物延伸循环的第一部分PCR扩增；3)包括若干变性和引物延伸循环的第二部分PCR扩增。所述引物延伸中所用PCR引物对中的一条引物的5′末端均加有一段与待扩增靶序列无关的寡核苷酸尾。本发明的不对称PCR扩增方法单链产率高，可进行单重或多重PCR扩增，在核酸检测中可以得到广泛应用。 　

主权项

1、一种不对称PCR引物，包括若干对PCR引物对，其特征在于：每对所述引物对中的一条引物的5′末端均加有一段与待扩增靶序列无关的寡核苷酸尾。

PCR产物的直接测序

凝胶纯化PCR扩增的靶序列

如果最佳PCR反应条件不能产生所需的特异性产物，可采用新的寡核苷酸重新进行扩增，或用凝胶电泳来分离不同的PCR产物，而后再各自重新扩增进行序列分析。长度不同的片段可以用琼脂糖凝胶电泳来分离:

1.片段大小在80-100bp时，可采用3%NuSieve1%普通琼脂糖或用聚丙烯酰胺胶来分离。　

2.从胶上切下含所南非PCR片段的薄片。

3.加入50∽100μlTE浸泡胶片，可反复冻融或放置几个小时使DNA从胶中扩散出来。

4.取少量(1-5%)进行第二次扩增，为得到纯净单一的产物，用于第二次PCR扩增 的凝胶抽提物的量必须少于1ng。

5.现已发现琼脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物质。因而，如需重新扩增供Tab聚合酶测序用的片段，最好用丙烯酰胺电泳分离。

当用PCR引物扩增几个同样长度的相关序列时，如来自几个新近复制的基因，或重复序列或保守的信号序列(conserved signal sequences)的同样显子，可以通过下列两种不同方法来改进电泳分离。1).先用只切割某一模板的内切酶进行酶切，而后电泳纯化完整的PCR产物。2).用可使核苷酸序列不同的扩增产物分开的电泳系统。下一个部份将讨论此类系统中的变性甲酰胺梯度凝胶系统。采用方法一时，必须事先了 解在不同PCR产物中的内切酶位点。

杂合体的直接测序

当两个等位基因由于单一位点突变而产生差异时，用一个PCR引物直接进行测序，能找出杂合位点。但是，带有几个点突变或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之一来直接测序，将产生复合序列带(compound sequencing ladders)。有四种 方法可以确定几种点突在型并从杂合体中获得单个等位基因的序列:1).克隆分离不同 的模板;2).在测序之前，利用模板之间核苷酸序列的差异，用电泳技术分离不同的模 板;3).在测序反应中只启动一个等位基因;4).只扩增一个等位基因。

测序模板的制备

与PCR产物的直接测序有关的一些问题是变性后由于扩增片段的两条链可以迅速结合起来，从而阻止了测序引物与它的互补序列退火，或阻止了引物──模板复合物的延伸。在测序反应中，模板链重新结合使一小部份模析骖与测序从而弱化最终的测序条带。为减少此问题，可用改进的标准双链DNA测序法或用PCR制备单链模板。

双链DNA模板

有两种不同方法用来制备测序用的模板，目前都已用来测定共价闭环双链质粒模板的序列。用这些方法来进行PCR产物的测序通常是较困骓的，因为短的线性模板比团环质粒的双链更易于重新结合。在这两种方法中，PCR片段可以由凝胶电胶或在电 泳前先进行旋转透析(Spin-dialysis)纯化。

1.在室温下，模板先在0.2M NaOH中变性5分钟，冰冻，加入0.4倍的5M醋酸铵 (pH7.5)来中和反应。立即用四体积的无水乙醇沉淀DNA。在合适的退火温度下，加入 测序缓冲引物。

2.在95℃下保温5分钟来变性模板，冰浴(或在干冰乙醇中)快速冷却离心管，以 减少链的重新结合。加入测序引物并使反应达到合适的温度。测序引物在变性前或后 加入都合适。

单链DNA模板

使用单链模板可以避免测序中链的重新结合。单链模板可以从双链DNA模板经链分离凝胶中制备，或用PCR反应制备。大于500bp的单链DNA片段，可从琼脂糖凝胶中分离笪到，但它不适合于更短的单链。制备单链DNA的另一种不同方法是在PCR反应中使用一个生物素标记的引物，变性后的PCR产物经过一个亲合素柱而使两条链得到分离，只有生物素标记的链才可结合到柱上。然而，最简单的方法是用改进的PCR方法，用此方法制备既定的单链DNA。在这个反应中(不对称PCR，asymmetric PCR)，在开始的20-25个循环中，两个比率不对称的扩增引物产生出双链DNA，当限量的那个引物耗光后，随后的5-10个循环就产生出ssDNA。单链DNA在约在25个循环后开始出现，这时限量的引物也几乎耗尽。经过一个短暂快速上升后，ssDNA就开始如预期的那样呈线性积累，这时反应中仅有一个引物存在。各种比率的引物都以这种形式产生 ssDNA。一般对100μlPCR反应体系而言，引物比率为50pmo:0.5pmol，经过30个循环后，大约可产生1-3pmol的ssDNA。ssDNA的产量可用下列几种方法来估计:a)。在PCR 反应中，除了加入正常数量的dDNA外，还加入32P-dNTP。取10%的反应产物在薄的3% NuSieve+1%普通琼脂糖凝胶中电泳，干燥并与胶片一起曝光。b).取5%的反应物来走胶，转移到膜上，并用与ssDNA互补的寡核苷酸为探针杂交。ssDNA不能用EB染色来定量，因为ssDNA有形成二级结构的趋势且染料的插入在模板中是随机的。使用不对称引物比例的扩增效率比两种引物均过量80-90%)的扩增效率低(70%)。在实验中，这可通过增加PCR循环的次数来弥补。若不对称的PCR反应不能产生足够数量的ssDNA，可以试一试不同的引物比率;b).再加5-10个PCR循环;c).在最后五个循环中多加Tab聚合酶(2U);d).试一下相反的不对称引物比率。有时，相反的不对称引物比率可能给出不同产量的ssDNA。制备出的单链DNA用限量的那个PCR引物或用一个内引物来测序，并 应用常规方法进行掺入测序(incorporation sequencing)或标记引物测序。制备出的 ssDNA链可能有一个不连续的5'-末端，但可能在靠近3'-末端不同位点处被切去，这是由于延伸过程中终止过早所产生的。然而，对于测序反应中所使用的任何一种引 物，只有完整的ssDNA可以用作测序模板。

最近还报道了另一种方法制备单链核酸模板进行直接测序。这种方法包括在一个 PCR引物上加入噬菌体的启动子，转录出该PCR产物的RNA拷贝，再用反转录酶不测序。但由于扩增反应后附加了一个酶促反应步骤和限于用反转录酶作为测序酶，这种 方法的应用受到很大的限制。

双链DNA模板

有两种不同方法用来制备测序用的模板，目前都已用来测定共价闭环双链质粒模板的序列。用这些方法来进行PCR产物的测序通常是较困骓的，因为短的线性模板比团环质粒的双链更易于重新结合。在这两种方法中，PCR片段可以由凝胶电胶或在电 泳前先进行旋转透析(Spin-dialysis)纯化。

1.在室温下，模板先在0.2M NaOH中变性5分钟，冰冻，加入0.4倍的5M醋酸铵 (pH7.5)来中和反应。立即用四体积的无水乙醇沉淀DNA。在合适的退火温度下，加入 测序缓冲引物。

2.在95℃下保温5分钟来变性模板，冰浴(或在干冰乙醇中)快速冷却离心管，以 减少链的重新结合。加入测序引物并使反应达到合适的温度。测序引物在变性前或后 加入都合适。

单链DNA模板

使用单链模板可以避免测序中链的重新结合。单链模板可以从双链DNA模板经链分离凝胶中制备，或用PCR反应制备。大于500bp的单链DNA片段，可从琼脂糖凝胶中分离笪到，但它不适合于更短的单链。制备单链DNA的另一种不同方法是在PCR反应中使用一个生物素标记的引物，变性后的PCR产物经过一个亲合素柱而使两条链得到分离，只有生物素标记的链才可结合到柱上。然而，最简单的方法是用改进的PCR方法，用此方法制备既定的单链DNA。在这个反应中(不对称PCR，asymmetric PCR)，在开始的20-25个循环中，两个比率不对称的扩增引物产生出双链DNA，当限量的那个引物耗光后，随后的5-10个循环就产生出ssDNA。单链DNA在约在25个循环后开始出现，这时限量的引物也几乎耗尽。经过一个短暂快速上升后，ssDNA就开始如预期的那样呈线性积累，这时反应中仅有一个引物存在。各种比率的引物都以这种形式产生 ssDNA。一般对100μlPCR反应体系而言，引物比率为50pmo:0.5pmol，经过30个循环后，大约可产生1-3pmol的ssDNA。ssDNA的产量可用下列几种方法来估计:a)。在PCR 反应中，除了加入正常数量的dDNA外，还加入32P-dNTP。取10%的反应产物在薄的3% NuSieve+1%普通琼脂糖凝胶中电泳，干燥并与胶片一起曝光。b).取5%的反应物来走胶，转移到膜上，并用与ssDNA互补的寡核苷酸为探针杂交。ssDNA不能用EB染色来定量，因为ssDNA有形成二级结构的趋势且染料的插入在模板中是随机的。使用不对称引物比例的扩增效率比两种引物均过量80-90%)的扩增效率低(70%)。在实验中，这可通过增加PCR循环的次数来弥补。若不对称的PCR反应不能产生足够数量的ssDNA，可以试一试不同的引物比率;b).再加5-10个PCR循环;c).在最后五个循环中多加Tab聚合酶(2U);d).试一下相反的不对称引物比率。有时，相反的不对称引物比率可能给出不同产量的ssDNA。制备出的单链DNA用限量的那个PCR引物或用一个内引物来测序，并 应用常规方法进行掺入测序(incorporation sequencing)或标记引物测序。制备出的 ssDNA链可能有一个不连续的5'-末端，但可能在靠近3'-末端不同位点处被切去，这是由于延伸过程中终止过早所产生的。然而，对于测序反应中所使用的任何一种引 物，只有完整的ssDNA可以用作测序模板。

最近还报道了另一种方法制备单链核酸模板进行直接测序。这种方法包括在一个 PCR引物上加入噬菌体的启动子，转录出该PCR产物的RNA拷贝，再用反转录酶不测序。但由于扩增反应后附加了一个酶促反应步骤和限于用反转录酶作为测序酶，这种 方法的应用受到很大的限制。