质粒系列之限制性克隆--restriction cloning

我们用两篇文章的篇幅大概讲了一遍质粒的骨架及其各个要素的介绍：

解剖式学习一个质粒结构--update

质粒系列之什么是质粒

简单梳理就是质粒大框架+小元件：大框架包含质粒复制起点，启动子，表达元件以及筛选标记，为了达到特定目的或细化功能，需要引入带有各种功能的小元件，而所有达成这个目的质粒元件拼凑行为，我们统称之为质粒重组。接下来我们会介绍几种常用的质粒克隆技术。

今日我们从最传统的质粒构建方法--限制性克隆开始说。

在开始之前我们简单讲一下质粒命名。质粒命名虽没有明确的规则，但也有一些约定俗成的命名习惯，可以帮助人们快速识别质粒特性。

1. 小写p开头 ， p在这里指代质粒（plasmid） ，所以我们常常看到 pXXXXX-XXXX 。

2. 质粒骨架 p后面接上质粒骨架名称， pBACKBONE-XXXX 。质粒骨架中包含promoter等等重要信息，一旦你对这个骨架熟悉，通过名称则很快能推测出质粒元件。addgene有专门的Vector Database可供查阅许多已发表或商业化的质粒空骨架信息。

3. 插入的基因名 ， pBACKBONE-hGene ，可以看到h在这里的意思是human。在质粒命名中经常会用小写字母来代替物种，小鼠m，大鼠r等等。对于Cas9会写SpCas9，Sp则意为 Streptococcus pyogenes （化脓性链球菌）。

4. 贴Tags ，通常插入的基因还会带有flag，需要按照出现顺序给出信息，比如我们前面文章提到的NLS-Cas9-NLS，这意味着Cas9前后各有一个核定位信号NLS，以保证Cas9的和核定位。

5. 标记突变信息 ，插入的基因时常带有特定突变，因此需要额外标记出来。而突变通常使用氨基酸表示，如Q295A代表：第295位谷氨酰胺（Glutamine）突变为丙氨酸 （Alanine）。

以上是质粒命名的一些通用规则，有时候质粒不一定严格按照以上规则命名，但可以举一反三，窥得其中一些规律。

例子：

限制性克隆是我们最常用的克隆技术，不仅操作便捷，单位价格低廉，还特别好使。限制性克隆，顾名思义，即使用限制性内切酶切开载体，并插入一段拥有适配酶切位点的片段，如下图：

在设计和进行限制性克隆实验时，需要考虑以下几点条件至少有以下几点：

在SnapGene等相关软件中，我们可以很好的模拟限制性克隆的过程（也不是所有过程都可以模拟），我们以以下为例，举例一个不太常规的限制性克隆实验。

如上图所示，插入片段两端的酶切位点和骨架质粒酶切位点并不兼容。在这种情况下，我们可以将左侧质粒的DsRed(FRT)GFP片段插入到一个包含MCS的中间质粒，再利用中间质粒的酶切位点与骨架质粒酶切位点兼容。

因为觉得插入中间质粒有点麻烦，所以我们决定设计使用PCR扩增DsRed(FRT)GFP片段并在primer末尾加入酶切位点，具体设计如下：

实验过程如下：

（1） 设计PCR 引物，并在primer末端加入 BsrGI酶切位点于GFP元件末端，同时在酶切位点外部加入4个保护碱基 。常规情况下，左侧还应该再重构相应的酶切位点，然而因为骨架质粒中我们选择的HpaI酶切位点产生的是平端末尾，因而左侧不再重构酶切位点。 对DsRed(FRT)GFP扩增产物进行酶切并胶回收 。

（2） 对骨架质粒66.2272.CAG.mCherry进行HpaI+BsrGI 两步酶切 （因为两种酶的buffer不兼容）。可选择对酶切产物进行去磷酸化（当时并没有做）。

（3） 使用T4连接酶连接→→感受态转化→→涂平板、挑菌落、质粒提取、测序验证、转染验证。

结果如下：

构建质粒各种步骤、各种困难，下面我们提供一个一步到位的办法，那就是：

相信大家都曾有过或现在都还有的一种想法（包括我自己），那就是作为博士生，你必须什么都会，凡事都要亲力亲为，不要想着买（尤其PI）。总觉得这个实验如果通过付费轻轻松松就达成，你不配被称为博士生。

在目标质粒是可获取的（尤其Addgene上质粒很便宜），还是要自己折腾个十天半个月，成功就还罢了，不成功的话还需要各种解决bug，花费大量的精力和试剂耗材在质粒构建上，也不过是做出了一个工具，与课题进度甚至无关，仔细算下来，还不如直接购买质粒划算。本人现在有一种感觉，质粒就抗体一样（毕竟大部分实验室不会想要自己做抗体，不排除一些实验室自己有实力，也是自己做的），不一定非要自己构建，除非非常简单或没得选择。