载体构建入门攻略——基因编辑载体篇
- 培训职业
- 2025-05-06 15:31:42
基因编辑技术，通过精准操作DNA实现基因改造，是现代科研的重要工具。其中，CRISPR-Cas9系统因其广泛应用而备受瞩目。这种技术通过Cas9蛋白与crRNA和tracrRNA的结合，利用PAM序列定位并切割DNA，引发DNA损伤修复，从而实现基因的定点编辑。构建CRISPR基因编辑载体是实践中的关键步骤，常用的eSpCas9载体包括ori（复制起始点）、U6启动子、CAG增强子（增强转录活性）、FLAG标签（便于纯化）、Cas9蛋白（如SpCas9和SaCas9）、转录终止子（如bGH poly(A) terminator）等元件。
在植物基因编辑中，需构建Cas9基因表达盒和sgRNA表达盒。Cas9通常由RNA聚合酶II启动子驱动，而sgRNA则由U3或U6启动子驱动。设计sgRNA时，首先要分析CD28等目标基因的转录本信息，选择非编码区的前1/3作为敲除位点，避免影响其他基因。常用的CRISPOR网站可帮助设计高特异性的sgRNA，然后通过BLAST比对确保其在基因组中的特异性。构建载体时，需考虑表达需求，包括reporter标签和药物筛选基因，通过酶切、退火、连接和转化等步骤完成。擎科生物提供包括靶点设计到载体合成的一站式服务，简化了整个过程。
多重随机标签